酶切雜帶的罪魁禍?zhǔn)?？全面了解星?hào)活性
我們知道，限制酶作為DNA的“分子剪刀”，一般都是老老實(shí)實(shí)識(shí)別特定的DNA序列，并在特定的位置切開(kāi)DNA。但有時(shí)，如果條件不合適，限制酶也會(huì)展現(xiàn)出一些“調(diào)皮”的行為，這就是所謂的“星號(hào)活性”（star activity）。
01 星號(hào)活性的發(fā)現(xiàn)
早在1975年，科學(xué)家們?cè)谘芯肯拗泼窫coRI（典型酶切位點(diǎn)G↓AATTC）時(shí)就發(fā)現(xiàn)，如果把反應(yīng)緩沖液中的離子強(qiáng)度降低，同時(shí)把pH值提高到8.5，EcoRI就會(huì)失去對(duì)兩側(cè)堿基的特異性，酶切位點(diǎn)變成N↓AATTN，即識(shí)別位點(diǎn)從六堿基變成了四堿基（圖1）。1978年，德國(guó)科學(xué)家Hubert Mayer進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，如果提高反應(yīng)液中的甘油等有機(jī)物濃度，EcoRI等限制酶也會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似的非典型位點(diǎn)切割現(xiàn)象。Mayer在論文標(biāo)題里，用EcoRI*-activity來(lái)表示這種非最優(yōu)條件下的非典型切割現(xiàn)象，并在論文正文中首次提出了star activity概念。
圖1
02 為什么叫“星號(hào)”活性
大家一定很好奇，為啥要用“星號(hào)活性”這個(gè)詞來(lái)描述限制酶這種非典型切割的活性呢？很可惜，首次提出這個(gè)概念的Mayer在論文里并沒(méi)有說(shuō)明原因。不過(guò)有兩種說(shuō)法來(lái)解釋這個(gè)有意思的命名：
一種說(shuō)法是，當(dāng)反應(yīng)條件發(fā)生變化時(shí)，限制酶出現(xiàn)了意想不到的行為，就像一顆游蕩的星星（Star），在典型切割位點(diǎn)之外的其他位置切割DNA。因此使用star activity一詞來(lái)描述這種不可預(yù)測(cè)的行為。
還有一種說(shuō)法是，如果將典型的限制酶識(shí)別序列想象成地圖上的主要路徑，當(dāng)限制酶處在非最優(yōu)條件下時(shí)，會(huì)偏離主路徑，朝其他方向運(yùn)行，類(lèi)似星形符號(hào)（*）的分叉。所以將這種活性命名為star activity。
03 星號(hào)活性是隨機(jī)切割的么？
雖然星號(hào)活性是在典型位點(diǎn)之外的非特異性切割，但從最初對(duì)EcoRI的研究中大家就能看出來(lái)，星號(hào)活性也不是完全隨便亂切的，只能叫部分非特異性切割。目前認(rèn)為，星號(hào)活性是限制酶的內(nèi)在性質(zhì)，在非最優(yōu)條件下，幾乎所有限制酶都可能產(chǎn)生星號(hào)活性。目前研究者只鑒定出少數(shù)限制酶的星號(hào)識(shí)別序列，每種酶產(chǎn)生星號(hào)活性的機(jī)制也不一定完全相同，相關(guān)研究還比較缺乏。在《限制性內(nèi)切酶在中國(guó)》一文中我們提到，中國(guó)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家在這方面的研究走在世界前列。
04 星號(hào)活性受哪些因素影響
導(dǎo)致星號(hào)活性產(chǎn)生的因素有很多，比如限制酶過(guò)量、孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、反應(yīng)液中甘油濃度過(guò)高（＞5% v/v）、低鹽濃度（＜25 mM）、非最佳pH、存在其他有機(jī)溶劑、存在除Mg2+之外的二價(jià)陽(yáng)離子等（圖2）。
圖2 某限制酶星號(hào)活性展示
05 如何控制星號(hào)活性
絕大多數(shù)情況下，星號(hào)活性對(duì)酶切反應(yīng)都是有害的，因此在實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)當(dāng)采取措施避免出現(xiàn)星號(hào)活性。一般而言，使用廠家隨酶提供的緩沖液，參照廠家說(shuō)明書(shū)給出的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)就不會(huì)出現(xiàn)星號(hào)活性。但實(shí)際酶切反應(yīng)操作中仍需遵循以下原則：
? 控制酶量和反應(yīng)體積。限制酶一般貯存在50%甘油中，因此總酶量不應(yīng)超過(guò)反應(yīng)總體積的10%（例如雙酶切總反應(yīng)體積為20 μl，則兩種酶合計(jì)加入的體積不應(yīng)超過(guò)2 μl）。反應(yīng)液體積不宜過(guò)小，以免反應(yīng)過(guò)程中水分蒸發(fā)提高甘油濃度。
? 選擇能完全切割所需的最短時(shí)間，過(guò)長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可能會(huì)引起星號(hào)活性。
? 使用推薦的緩沖液，不同離子強(qiáng)度和pH值的緩沖液可能會(huì)引起星號(hào)活性。
? 確保反應(yīng)體系中不含其他有機(jī)溶劑，如制備DNA過(guò)程中可能會(huì)混有的乙醇。
? 反應(yīng)液中注意不要含有Mg2+之外的二價(jià)陽(yáng)離子，其它二價(jià)陽(yáng)離子不適合限制酶的活性位點(diǎn)，會(huì)對(duì)其正確識(shí)別造成干擾。
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