在限制酶種類知多少（上）中，我們介紹了細(xì)菌的“限制-修飾”(R-M) 系統(tǒng)，限制酶的命名方式，Type I限制酶和Type II中幾個(gè)主要的亞類。這期我們來繼續(xù)了解其他的限制酶種類。

?Type IIA

Type IIA類限制酶識(shí)別非對(duì)稱 (asymmetric) 序列，并在識(shí)別序列內(nèi)部或距離識(shí)別序列特定距離的位點(diǎn)切割。因此，很多識(shí)別非回文序列的Type IIS亞類限制酶，如BspQI (GCTCTTC(1/4))，同時(shí)也屬于Type IIA亞類。

?Type IIE

Type IIE是一類特殊的Type IIP亞類，單體蛋白在催化結(jié)構(gòu)域之外，還包含一個(gè)變構(gòu)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域 (allosteric effector domains)，兩個(gè)單體再組成同源二聚體。與普通的Type IIP限制酶不同，Type IIE類限制酶需要同一條DNA底物上有兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)才能更有效行使功能，其中一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)與催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合作為切割位點(diǎn)，另一個(gè)與變構(gòu)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，作為激活位點(diǎn)增強(qiáng)酶的活性。這一類型的典型代表是EcoRII/PspGI (/CCWGG) 和NaeI (GCC/GGC)。

圖6 Type IIE限制酶的亞基組成和切割模式

?Type IIF

Type IIF同樣是一類需要結(jié)合兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶。這類限制酶一般形成同源四聚體，四個(gè)亞基結(jié)合兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，然后同時(shí)切開兩個(gè)位點(diǎn)上的四條 (four) DNA鏈（雙鏈DNA的每個(gè)區(qū)域包含兩條單鏈），例如SfiI (GGCCNNNN/NGGCC)。當(dāng)然，有些Type IIF限制酶也屬于Type IIE類，兩個(gè)酶切位點(diǎn)中有一個(gè)可能也會(huì)產(chǎn)生變構(gòu)效應(yīng)。

圖7 Type IIF限制酶的亞基組成和切割模式

?Type IIH

?Type IIM

?Type IIT

圖8 Type IIT限制酶的亞基組成

Type III限制酶往往以同源二聚體的形式行使功能，其單體蛋白同時(shí)具有限制酶和甲基化酶兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，同時(shí)還需要Mg²⁺、ATP和SAM作為輔助因子。Type III限制酶識(shí)別位點(diǎn)是同一個(gè)DNA分子上的兩段反向的序列（大多數(shù)含有A），單個(gè)識(shí)別序列本身一般是非回文的，但兩個(gè)識(shí)別序列反向?qū)ΨQ。兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)之間的間隔序列無特異性，長(zhǎng)度變化較大。Type III限制酶的切割位點(diǎn)在其中一個(gè)識(shí)別序列之外固定距離的位置，有時(shí)切割不完全，很少被用作工具酶。

圖9 Type III限制酶的幾種切割模式

(a) 跟蹤碰撞模型；(b) 滑動(dòng)模型；(c) 一維擴(kuò)散模型

但是，由于Type III限制酶的切割位點(diǎn)和識(shí)別位點(diǎn)之間的間隔（一般24~28 bp）超過Type IIS，因此一些特殊應(yīng)用中也會(huì)使用Type III限制酶。例如EcoP15I (CAGCAG(25/27)) 就曾被用于基因表達(dá)系列分析 (Serial Analysis of Gene Expression,SAGE) 和亨廷頓舞蹈癥的致病基因（密碼子CAG出現(xiàn)異常重復(fù)）分析。

Type IV限制酶最初是在T4噬菌體與大腸桿菌的相互作用中被發(fā)現(xiàn)的。這類酶組成形式多樣，不同種類可以識(shí)別并切割m6A、m5C、hm5C等多種甲基化位點(diǎn)，但序列特異性較差。被人們熟知的是來自大腸桿菌的McrA、McrBC和Mrr。在某些工程菌株中，Type IV限制酶的編碼基因需要被突變或敲除，以免影響外源基因表達(dá)。

近年來，隨著表觀遺傳學(xué)飛速發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)不同的Type IV限制酶可以區(qū)分不同的甲基化修飾形式，于是嘗試將Type IV限制酶用作表觀遺傳學(xué)研究，例如使用McrBC分析CpG二核苷酸的甲基化狀態(tài)。

結(jié)語(yǔ)

限制酶作為基因工程最早也是最基礎(chǔ)的工具酶，仍發(fā)揮著強(qiáng)大的生命力。伴隨著基因組學(xué)，尤其是宏基因組學(xué)的發(fā)展，仍不斷有新的限制酶被測(cè)序鑒定出來，不斷豐富著生物學(xué)家的武器庫(kù)。

愚公生物在限制酶領(lǐng)域探索多年，目前產(chǎn)品已經(jīng)覆蓋了Type IIP（含Type IIE、Type IIF）、Type IIS、Type IIM、切刻內(nèi)切酶等多個(gè)亞類。未來我們將繼續(xù)扎根細(xì)分領(lǐng)域，不斷推出新的限制酶產(chǎn)品，為中國(guó)生物醫(yī)學(xué)行業(yè)提供更多優(yōu)質(zhì)、經(jīng)濟(jì)、使用方便的工具，助推中國(guó)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

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