2024年5月底，美國FDA批準了Moderna公司的第二款mRNA疫苗——針對呼吸道合胞病毒（RSV）的mRESVIA（mRNA-1345）。這是全球獲批的首款非新冠mRNA疫苗。再次展現(xiàn)了mRNA疫苗的巨大潛力。

       在mRNA疫苗的開發(fā)和生產(chǎn)過程中，將包含有抗原基因的環(huán)狀質粒DNA變成線狀DNA，作為此后體外轉錄反應的模板，是非常關鍵的步驟。這一步主要通過限制性內(nèi)切酶的定點酶切反應完成。

       在此，愚公生物為選擇mRNA疫苗開發(fā)限制酶提供如下建議：

01 選擇識別序列較長的限制酶

       質粒線性化的首要要求就是酶切位點不能出現(xiàn)在抗原基因的內(nèi)部。6堿基以上的識別序列，出現(xiàn)在基因內(nèi)部的可能性比較小，減少了基因序列的設計難度。因此需要選擇具有較長識別序列的限制酶。

02 酶切產(chǎn)物末端應為5'突出

       限制酶酶切產(chǎn)物末端應該為5'突出，因為5'突出末端出現(xiàn)在體外轉錄的模板鏈上。而編碼鏈末端的3'突出，會增加體外轉錄產(chǎn)生雙鏈RNA (dsRNA) 副產(chǎn)物的風險。

       如下圖所示，BsaI、XbaI、XhoI酶切產(chǎn)物均為5'突出。而PstI、SacI酶切產(chǎn)物均為3'突出，不適合用于mRNA質粒模板線性化。

03 無需拘泥于Type IIS限制酶

       一般認為，Type IIS限制酶是質粒線性化的首選，因為Type IIS限制酶的酶切位點在識別位點之外，且切割不受序列限制，可以產(chǎn)生不含任何多余序列的模板。

       但實際上很多藥企已經(jīng)證明，Type IIP限制酶，如XbaI、XhoI、NheI、EcoRI等同樣可以用來進行質粒模板線性化，并不會影響mRNA疫苗的效果和安全性。也有部分研究表明，如果poly(A)尾的3'末端帶有額外的酶切位點，還有可能增加mRNA的穩(wěn)定性。

04 無動物源性

       生物制品中的動物源成分存在安全和質量風險，各國藥典都要求優(yōu)先考慮使用無動物源材料。

       愚公生物推出的GMP和ADCF（無動物源性成分）系列限制酶，采用化學成分明確、無動物源性和無人源性成分培養(yǎng)基表達，并經(jīng)過多步的層析純化獲得。產(chǎn)品的表達、純化和制劑等工藝過程中沒有使用含動物源性和人源性成分的試劑，也未使用氨芐青霉素及其他抗生素。生產(chǎn)設施和包裝材料也沒有使用動物或者動物制品或動物病原體。此外，愚公生物的所有酶制劑最終配方中不含有牛血清白蛋白，取而代之的是更安全可控的重組白蛋白（rHSA）。

05 關注使用后殘留

       限制酶作為中間原料，在完成反應后就屬于工藝相關雜質，需要及時去除，避免帶來未知風險。根據(jù)法規(guī)，對生物制品制造過程中的殘留原料蛋白要進行過程控制檢測。為此，愚公生物推出了多種限制酶的殘留檢測試劑盒（見新品推介l限制酶BsaI殘留檢測試劑盒），用于mRNA原料質量控制。

06 關注酶的穩(wěn)定性

       疫苗與藥物開發(fā)與生產(chǎn)對工藝穩(wěn)定性要求極高。限制酶作為關鍵原料之一，其儲存穩(wěn)定性也直接影響了工藝的效果。因此應當盡量選擇穩(wěn)定性更好的酶。

       此外，酶的最適反應溫度可能也會影響mRNA質粒模板線性化的效果，但對于這個因素業(yè)內(nèi)尚無明確的共識，所以可以根據(jù)自身的需求選擇。

       愚公生物擁有國內(nèi)領先的GMP-like原料酶生產(chǎn)線，提供多種GMP級別和無動物源性限制酶，并接受無動物源性限制酶定制，為國內(nèi)外mRNA疫苗開發(fā)與生產(chǎn)提供優(yōu)質原料。

                                                        愚公生物車間圖

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